產(chǎn)品名稱：

SABC(小鼠IgG)-POD kit

產(chǎn)品規(guī)格：

100-200T

產(chǎn)品貨號(hào)：

SA0011

產(chǎn)品單位：

盒

供貨商：

上海信帆生物

SABC(小鼠IgG)-POD kit

SABC（Strept Avidin-Biotin Complex）法是一種顯示組織和細(xì)胞中抗原分布的簡(jiǎn)便而敏感的免疫組化染色方法。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，其比直接酶標(biāo)二抗敏感5-10倍，是免疫組化的理想方法。

基本原理

SABC(小鼠IgG)-POD kit

SABC是鏈霉親和素-生物素-酶（或者FITC）復(fù)合物。

親和素（Avidin）存在于雞蛋中，分子量67000，是一種堿性蛋白。對(duì)生物素有很強(qiáng)的結(jié)合力。鏈霉親和素是從鏈霉菌中提取的一種蛋白質(zhì)，分子量47000，等電點(diǎn)為6.0-6.5，也對(duì)生物素有很強(qiáng)的結(jié)合力，但其等電點(diǎn)接近中性，明顯消除了原堿性蛋白所引起的非特異性吸附。

生物素活化后，可以標(biāo)記抗體和酶而不影響其活性。再經(jīng)SABC放大，一分子的抗體可以結(jié)合幾十分子的酶或者熒光素，從而有很強(qiáng)的放大作用。

SABC是專為免疫組化和其他免疫檢測(cè)而設(shè)計(jì)的，用以顯示組織和細(xì)胞中抗原分布。鏈霉親和素(StreptAvidin)是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質(zhì)，同親和素一樣，對(duì)生物素有*的親和力，親和素是一個(gè)堿性蛋白質(zhì)（IP=10），經(jīng)改造后可以轉(zhuǎn)變成中性蛋白質(zhì)。鏈霉親和素等電點(diǎn)接近中性，對(duì)組織和細(xì)胞的非特異吸附很低，基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。SABC即StreptAvidin—Biotin Complex。SABC大約可形成一百個(gè)左右的過(guò)氧化物酶和五十個(gè)左右的鏈霉親和素所構(gòu)成的復(fù)合物。大量的酶將保證SABC具有很高的敏感性。

SABC(小鼠IgG)-POD kit

自備試劑：

1．粘片劑多聚賴氨酸。

2． 0.01 M PBS（pH7.2-7.4）

3． 0.01M檸檬酸鈉緩沖液

4、抗熒光衰減封片劑

實(shí)驗(yàn)步驟:

以石蠟切片熱修復(fù)為例

1. 切片常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶（如果FITC，剛可省掉此步）。蒸餾水洗3次。

2．熱修復(fù)抗原:將切片浸入0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0）,電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10分鐘后，反復(fù)1-2次。冷卻后PBS（pH7.2-7.6）洗滌1-2次。

3．滴加5%BSA封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體, 不洗。

4．用稀釋液將一抗（如兔抗IL-10）按一定比例稀釋（稀釋后的一抗4℃可保存一周），也可另行購(gòu)買抗體稀釋液。滴加稀釋的一抗，37 ℃ 1小時(shí)左右或20℃時(shí)2小時(shí)左右。也可4℃過(guò)業(yè)。PBS（pH7.2-7.4）洗2分鐘×3次。（一抗的稀釋度、孵育時(shí)間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性染色強(qiáng)度不夠時(shí)，可提高一抗?jié)舛群脱娱L(zhǎng)孵育時(shí)間；背景過(guò)高時(shí)，可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時(shí)間。）

5．根據(jù)使用量,用稀釋液將生物素化二抗?jié)饪s液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul生物素化羊抗兔IgG濃縮液,混勻即成工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加生物素化羊抗兔IgG工作液,20-37℃ 30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗2分鐘×3次。

SABC(小鼠IgG)-POD kit

如果想用熒光觀察，請(qǐng)接下面步驟，如果想用DAB顯色，請(qǐng)?zhí)^(guò)6-7。

6．根據(jù)使用量,用稀釋液將SABC-FITC濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-FITC濃縮液，混勻即成SABC-FITC工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-FITC工作液,20-37℃，30分鐘(避光)。PBS（pH7.2-7.4）洗5分鐘×4次。

7．滴加抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡觀察。

如果想用DAB顯色，請(qǐng)接8。

8．根據(jù)使用量,用稀釋液將SABC-POD濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-POD濃縮液，混勻即成SABC-POD工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-POD工作液,20-37℃，30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗5分鐘×4次。

9．DAB顯色:根據(jù)用量，用PBS（pH7.2-7.4）配制，按1mlPBS加入50ul 20×DAB顯色液A，加入50ul 20×DAB顯色液B ?；靹蚝蠹又燎衅?。室溫顯色, 鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在5-30分鐘之間。蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。

10．蘇木素輕度復(fù)染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。

對(duì)于細(xì)胞片，常規(guī)固定后，PBS漂洗兩次，再用0.5%Txiton X-100室溫20分鐘，PBS漂洗兩次，3%H2O2（如果FITC，剛可省掉此步）處理15分鐘；PBS漂洗兩次，下接上面第4步。

對(duì)于冰凍切片，固定后，可用PBS漂洗兩次，再接上面第二步。

注意事項(xiàng)：如果染色背景過(guò)高，在SABC反應(yīng)之后，DAB顯色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次，PBS洗2次，然后DAB顯色。

因?yàn)槊庖呓M化指標(biāo)眾多，標(biāo)本不一，此步驟僅作參考。

注意事項(xiàng)：如果染色背景過(guò)高，在SABC反應(yīng)之后，用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次，PBS洗2次，然后封片觀察。

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